研究捷安肽素抗真菌作用机理

【摘要】  　　目的 研究捷安肽素的抗真菌作用机理。方法 采用形态学方法和同位素标记法。显微形态观察经捷安肽素处理后的供试真菌的形态学变化。进一步采用14C同位素标记的特异底物“尿苷二磷酸-（14C）-葡萄糖”示踪，研究捷安肽素对真菌(1,3)-β-D-葡聚糖合成酶活性反应的影响。结果 显微形态观察表明，经捷安肽素处理后，供试真菌呈现球形膨胀，而且随着捷安肽素作用强度增强，球形膨胀的程度和发生频率也增加，提示捷安肽素的作用位点在真菌细胞壁。同位素标记实验表明，捷安肽素可抑制（1,3）-β-D-葡聚糖合成酶的活性，降低真菌细胞壁合成过程中（1,3）-β-D-葡聚糖的放射性掺入，对疫霉菌和辣椒炭疽病菌（1,3）-β-D-葡聚糖合成酶的抑制率分别达到77.7%和77.5%。结论 捷安肽素的抗真菌作用机理为：抑制细胞（1,3）-β-D-葡聚糖合成酶的活性，破坏真菌细胞壁的合成，造成真菌细胞壁组分（1,3）-β-D-葡聚糖的缺损和病原真菌生长抑制。
【关键词】  捷安肽素；抗真菌作用机理；（1,3）-β-D-葡聚糖合成酶
　　A Research on Mechanism of Antifungal Polypeptide Jiean-peptide
    DAI Fu-ying1,ZHOU Jin-yan2,TAN Hong2
    （1.Department of Pathogenic Biology,Chengdu Medical College,Chengdu 610083；2.Chengdu Institute of Biology,CAS,Chengdu 610041）
    Abstract：Objective To investigate the antifungal mechanism of Jiean-peptide.Methods The mode of action of Jiean-peptide against 4 phytopathogenic filamentous fungi associated with phytopathy:Phytophthora sp.,Colletotrichum gossypii,Southw Botrytis cinerea and Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum was investigated by the method of morphology and isotope labelling.The (1,3)-β-D-glucan synthase assay was processed using isotope labelled substrate—urdine diphosphate(14C)glucose to study the effect of Jiean-peptide on fungal(1,3)-β-D-glucan synthase.Results Micrographic observation revealed that the Jiean-peptide made the hyphal expanded and globular.The(1,3)-β-D-glucan synthase assay showed Jiean-peptide could inhibit the activity of(1,3)-β-D-glucan synthase and reduce the radioactivity incorporation of(1,3)-β-D-glucan.The inhibition percentages of Jiean-peptide against Phytophthora sp.and Colletotrichum gossypii Southw were 77.7% and 77.5% respectively.Conclusion The antifungal mechanism of Jiean-peptide was the inhibition of enzyme activity of(1,3)-β-D-glucan synthase.
    Key words:Jiean-peptide；antifungal mechanism；(1,3)-β-D-glucan synthase
      捷安肽素是一种由芽孢杆菌产生的抗真菌活性多肽，具有广谱抗真菌活性，而且稳定性好、抑菌持久，具有很好的开发前景［1，2］。从捷安肽素对疫霉菌、辣椒炭疽病菌、灰霉菌、棉花枯萎病菌等多种常见重要植物病原真菌的抑菌性能可知，捷安肽素可以通过抑制真菌孢子萌发、菌丝生长而发挥抗真菌生长作用。形态观察发现，捷安肽素可以破坏真菌的细胞壁结构，使真菌细胞呈现原生质球状［3］。（1,3）-β-D-葡聚糖合成酶（EC2.4.1.34；尿苷二磷酸-葡萄糖/(1,3)-β-D-葡聚糖-3-β-葡糖基转移酶）是一细胞膜结合酶，在细胞膜内侧聚合UDPG形成葡聚糖纤维，葡聚糖纤维分泌出细胞膜形成网状支架，对真菌细胞壁的完整性及保护真菌抵抗低渗透压起重要作用［4，5］。本文作者采用形态学方法和同位素标记法研究捷安肽素对真菌细胞壁及其（1,3）-β-D-葡聚糖合成酶的作用，进一步深入探讨捷安肽素的抗真菌作用机理，为捷安肽素的进一步开发提供理论基础。
    1  材料
    1.1  菌种
    疫霉菌（Phytophthora sp.）、辣椒炭疽病菌（Colletotrichum gossypii Southw）、灰霉菌（Botrytis cinerea）、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum），均为本实验室保藏菌种。
    1.2  培养基
    马铃薯葡萄糖液体培养基。
    1.3  主要试剂
    捷安肽素原液（生物效价为19.5 mm）由本实验室提供；尿苷二磷酸-（14C）-葡萄糖［UDP-（14C）-G］，Perkin-Elmer进口产品；2,5-二苯基  唑（2,5-Di-phenyloxazole,PPO），Fisher进口产品。（捷安肽素的生物效价采用管碟法［2］测定，以疫霉菌为检验菌株，以抑菌圈直径为效价指标）。
    1.4  主要溶液
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