补肾化痰法对Alzheimer病模型大鼠行为学的影响及作用机制

                        作者：胡慧, 王平, 孔明望, 丁凤敏

【摘要】   目的 观察补肾化痰法对AD模型大鼠行为学的影响并探讨其可能机制。方法 应用脑立体定向技术给大鼠BNM注射凝聚态Aβ2535＋IBO构建AD模型。注射2周后，高、中、低量组分别给大鼠该药水煎液灌胃；西药组用哈伯因混悬液灌胃；正常组、空白组、模型组均给予等容积的生理盐水灌胃。28 d后采用Morris 水迷宫进行行为学评价。结果 行为学结果显示高、中、低量组和西药组的平均潜伏期较模型组有明显缩短（P<0.01）；高、中量组的象限百分比较模型组有明显提高（P<0.01），20 %、40 %区域较模型组有明显减少（P<0.01）；模型组大鼠空间探索的象限百分比和跨过原平台位置次数比正常组和空白组明显降低（P<0.01）。西药组和高、中、低量组的象限百分比和跨过原平台位置次数较模型组有明显提高（P<0.01），并呈现一定量效关系（P<0.01）。结论 补肾化痰法可显著改善AD模型大鼠的学习记忆障碍。

【关键词】   补肾化痰法； Alzheimer； 行为学

    【Abstract】  Objective To observe effects and function mechanism of replenishing kidneyessence and removing phlegm therapy on behavior in the rat of AD.Methods Application of technology to stereotactic brain of rats injected BNM condensed Aβ2535 + IBO build AD model. 2 weeks after injection, high, medium and low volume of the rats were administered the drug decoction; western medicine group with Huperzine oral suspension; normal group, blank group, model group were given equal volume of normal saline ig. 28 days after the Morris water maze used for behavioral evaluation.Results Behavioral results showed high, medium and low volume group and western medicine group than the average incubation period of the model group was significantly shorter (P<0.01); high percentage of the volume group than the quadrant of the model group had markedly improved (P<0.01), 20 %, 40% than the region has significantly reduced the model group (P<0.01); model group the percentage of space exploration and the quadrant across the former platform position than the normal group and blank group were significantly lower (P<0.01). Western medicine group and the high, medium and low percentage and crossed the quadrant the original platform location of the volume group than in the model group had markedly improved (P<0.01), and a certain doseeffect relationship (P<0.01).Conclusion Bushen Huatan method(replenishing kidneyessence and removing phlegm therapy) can significantly improve the AD model of learning and memory impairment in rats.

    【Key words】  replenishing kidneyessence and removing phlegm therapy;  Alzheimer;  behavior

    阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种以进行性记忆障碍和智能衰退为主要临床特征的中枢神经系统退行性疾病，随着人口老龄化的日趋严重，AD已经成为危害老年人健康的主要疾病之一［1］，是目前公认具有世界性的公共卫生事业重大问题，被称为“即将到来的21世纪的瘟疫”［2，3］。目前AD病因和病理机制尚未完全明了，更无确切疗效的药物。寻找确能根治AD药物已成为当今国际热点课题之一。

    目前西医主要是对症 治疗 ，治疗的目的是延缓AD的进展和促进神经元的功能恢复以改善症状。治疗的策略是根据现有损害神经元的各种因素或AD脑中代谢异常来设计不同作用位点的各种药物，但是这些药物价格昂贵，毒副作用较大，不能支持老年人用药的要求［4，5］。中医药在延缓衰老以及衰老相关疾病的防治方面有着丰富的理论和实践经验，以其疗效较好、综合效益高、副作用少而显示了良好的前景。为此，我们首先建立了大鼠AD模型，并采用Morris 水迷宫进行行为学测试，观察补肾化痰法对AD模型大鼠行为学的影响，并用哈伯因混悬液作对照，旨在进一步探讨中药治疗AD的作用及机理。

    1  实验材料

    1.1  动物

    15月龄Wistar大鼠70只，雌雄各半，体重450±50 g，由湖北省实验动物研究中心提供。

    1.2  主要试剂

    Aβ2535和IBO购于Sigma公司。

    1.3  主要仪器和设备

    Morris水迷宫装置（ 中国 医学 科学 院），脑立体定位仪（北京硕林苑科技有限公司），微量注射器 1 μl（上海医用激光仪器厂）， 电子 天平（AL104，梅特勒托利多公司）。

    1.4  药物

    补肾化痰方由制首乌、石菖蒲、竹节参、茯苓、陈皮、半夏、白芥子等组成,购自湖北中医学院国医堂门诊部。中药经水煎制成浓缩液。哈伯因,购自河南众生制药股份有限公司豫中制药厂,批号:060321.

     2  实验方法

    2.1  动物分组

    ①Aβ2535+IBO模型组（简称模型组）,②假手术组（简称空白组）,③正常组, ④哈伯因治疗组（简称西药组）,⑤补肾化痰法高剂量组（简称高量组）,⑥补肾化痰法中剂量组（简称中量组）,⑦补肾化痰法低剂量组（简称低量组）。

    2.2  AD模型构建

    模型组大鼠用2 ％戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后，固定于脑立体定位仪上，颅顶正中切开暴露至颅骨，根据大鼠颅脑立体定位图谱，对基底核立体定位（位置:前囟后 3.8 mm，中线旁开 2.5 mm，深度 3 mm），用牙科钻钻开颅骨，用1 μl 微型进样器注射针5 min 内缓慢注入Aβ2535+IBO混合液 1 μl，留针10 min.注射完毕后以局部软组织封闭针孔，缝合皮肤。术后给予青霉素钠盐 5 万单位肌注，每天1次，连续 3 d.空白组在定位下给予大鼠BNM一次性注射 1 μl 灭菌生理盐水。

    2.3  给药

    脑内注射2周后给药。给药量均按人与大鼠体表面积系数比确定，以临床人用药等效剂量为中剂量，模型组、空白组、正常组给予生理盐水灌胃，1 ml/100 g·d，连续28 d.西药组给予哈伯因混悬液灌胃，1 ml/100 g·d，连续28 d.高量组、中量组、低量组分别给予补肾化痰方水煎液灌胃，含生药分别是2 g/ml，1 g/ml，0.5 g/ml，1 ml/100 g·d，连续28 d.

    2.4  检测指标及方法

    2.4.1  Morris水迷宫实验  造模结束后进行Morris水迷宫行为检测，评价其学习记忆成绩。主要进行定位航行和空间探索实验。

    2.4.1.1  定位航行实验  定位航行实验用于测量大鼠通过一段训练后，对空间的学习记忆能力。每日上下午各4次,将大鼠面向池壁分4个象限放入水中,记录其在2 min内寻找到平台的时间（逃避潜伏期）。如果大鼠在2 min内未找到平台，则用手牵引其至平台上，让大鼠停留10 s， 计算 机会自动记录大鼠在实验期间的行程，并转换为行程转迹图，所经过长度、所需的时间，每个象限的行程长度、每个象限行程的时间、速度、各个象限的行程长度占总长度的百分比，各个象限的行程时间占总时间的百分比。数据的采集和处理由Morris迷宫图像自动监视处理系统完成，历时4 d.

    2.4.1.2  空间探索实验  5 d撤除平台，进行空间探索实验。将大鼠任选1个入水点放入水中，记录其2 min内跨越原平台位置的次数。

    两实验还记录大鼠在平台象限的游泳距离占总距离百分比，池壁20 %和40 %区域游泳距离百分比，以判断动物记忆储存及再提取能力。

    2.5  统计处理

    所有计量检测结果以均数±标准差（±s）表示。采用SPSS FOR WINDOWS 15.0统计软件包统计分析。